基因合成是指在體外人工合成雙鏈DNA分子的技術(shù)。基因合成是用人工方法合成基因的技術(shù)，是基因獲取的手段之一，相對于從已有生物中獲取基因來說，基因合成無需模板，因而不受基因來源限制。

 

什么是基因合成

 

基因合成是依照某一蛋白質(zhì)的基因序列，設(shè)計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸，再通過重疊延伸PCR法拼接出全長，基因合成無需模板，是獲取基因的手段之一以提高在異源宿主的表達量行全基因合成，目前該技術(shù)主要應(yīng)用在基因的異源表達上，對基因密碼子優(yōu)化后進。

 

此外，基因合成技術(shù)還用于合成一些不易獲取模板的基因或者自然界不存在的新基因等。基因合成技術(shù)可以按照人們的意愿設(shè)計且靈活地合成，正好符合了當(dāng)代生物學(xué)發(fā)展的潮流，將會在越來越多的領(lǐng)域得到應(yīng)用，并且發(fā)揮巨大的作用。

 

基因合成的方法主要有組裝PCR重疊延伸PCR、TBIO法、PTDS法等。困擾全基因合成技術(shù)的問題主要有2個：①合成基因中堿基錯誤率高。②合成成本高。

 

在基因合成前，為使基因在不同生物表達體系中都能得到良好表達，研究人員通常會對基因進行密碼子優(yōu)化。遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些???碼子中的一部分，那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子。

 

實際上用做蛋白表達或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞，植物細胞和昆蟲細胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子偏愛性，因此，重組蛋白的表達可能受密碼子利用的影響(尤其在異源表達系統(tǒng)中)。

 

在不改變其編碼蛋白的情況下，對一個蛋白的編碼基因進行改變，去除稀有密碼子，合理優(yōu)化其mRNA二級結(jié)構(gòu)，GC含量等的過程叫密碼子優(yōu)化。密碼子優(yōu)化的原理即根據(jù)將要使用的表達系統(tǒng)的密碼子偏愛性，針對目標蛋白序列中的每一個氨基酸選擇不同的密碼子進行全序列的組合，找出其中*的一條。

 

1、引物合成

 

研究人員根據(jù)自己的意愿確定合成的基因序列后，由于沒有模板，首先需根據(jù)待合成的雙鏈DNA設(shè)計引物、合成引物。引物，又名引子，是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點，在核酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈。

 

在PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)中，已知一段目的基因核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物，利用PCR擴增技術(shù)，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重復(fù)循環(huán)，延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合。

 

簡單地說，引物即是短的單鏈DNA或短的RNA鏈，序列長度一般為15～90nt(nt為引物堿基單位，有些也用nt或bp標識)，一般不超過120nt。目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA偶聯(lián)在固相載體上完成DNA鏈的合成的，引物合成的方向依據(jù)既定引物序列由3'端向5'端延伸，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。

 

2、引物互為模板PCR擴增

 

引物合成后，引物之間互為模板進行PCR擴增。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

 

PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

 

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備;

 

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;

 

③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。

 

重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

 

 

3、連接轉(zhuǎn)化、菌檢送測

 

通過PCR反應(yīng)，可擴增出我們需要的雙鏈DNA。但PCR產(chǎn)物穩(wěn)定性較低，我們需將連接到質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化進感受態(tài)中，涂平板過夜培養(yǎng)。第二天早上就可以從平板中挑選陽性克隆，挑到的克隆需要再次使用菌落PCR驗證是否有全長的基因插入，使用首尾引物進行PCR，如果有產(chǎn)物，說明有目的基因。將驗證過的克隆轉(zhuǎn)化進入試管培養(yǎng)搖菌，之后，抽提質(zhì)粒，純化送去進行測序。

 

4、一代測序

 

目前，我們采用的是一代測序，也叫sanger測序。Sanger法測序利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入*的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。

 

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。

 

它們具有共同的起始點，但終止在不同的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

 

5、QC驗證

 

將測序結(jié)果與目標基因進行比對，同時進行QC酶切驗證，如果測序結(jié)果與酶切驗證結(jié)果均正確，就完成目的基因的合成了。按照上述步驟，順利的情況下5天時間就能合成出一段800bp左右的基因序列。

 

目前，基因合成周期短，同時可以保證序列的100%正確無誤，具有很大的靈活性，可以對基因的酶切位點和基因序列進行修改，方便下游的克隆和實驗;研究人員根據(jù)自己的意愿設(shè)計得到自然界中很難獲得甚至不存在的基因;基因合成的基因可以進行密碼子優(yōu)化，使基因在各種生物表達體系中都能得到良好表達。

 

這些優(yōu)點使得基因合成在生物領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，比如克隆人鼠抗體或重組抗體、合成不同的基因突變株、SNPS或其他突變株、設(shè)計合成DNA疫苗、大量合成用于微芯片的cDNA等。基因合成技術(shù)的發(fā)展使生物領(lǐng)域又上了一個新臺階。

 

基因合成產(chǎn)業(yè)

 

美國基因合成產(chǎn)業(yè)發(fā)達，有賴于發(fā)達的生物產(chǎn)業(yè)，政府與企業(yè)在基因業(yè)務(wù)上投入比較大，而國內(nèi)大批量投入的科研產(chǎn)業(yè)少，基因合成市場有限，客戶主要是科研單位。未來中國的基因合成產(chǎn)業(yè)，很大程度上受到國家對生物產(chǎn)業(yè)的政策引導(dǎo)的影響。

 

國外分析機構(gòu)的數(shù)據(jù)顯示，2014年全球包括工業(yè)級和科研級在內(nèi)的合成基因市場規(guī)模為20億美元，其中中國1.2億美元，僅占6%。這個小數(shù)據(jù)表明，國內(nèi)生物產(chǎn)業(yè)自己研發(fā)的東西太少，大部分國內(nèi)生物制藥企業(yè)，還是持續(xù)依靠復(fù)制國外技術(shù)，甚至等技術(shù)過期后直接拿來用，這樣并不需要合成基因。

 

因為合成基因只有在前期研發(fā)的時候才有較大的應(yīng)用空間，如果研發(fā)投入少，基因合成出來沒有消耗的市場，投入相應(yīng)就會小很多。國內(nèi)生物制藥企業(yè)長期只是模仿，路會越走越窄，發(fā)展到一定程度就會遇到很大的瓶頸。

 

 

從另一方面看，各國的生物產(chǎn)業(yè)都受到一定的限制，這是由行業(yè)特征決定的：生物產(chǎn)業(yè)是一個長期投入、高投入、成功率不高的產(chǎn)業(yè)，不像其他行業(yè)那樣能更快地產(chǎn)業(yè)化。

 

經(jīng)過十幾年的發(fā)展，整個基因合成行業(yè)已經(jīng)很成熟，然而，也引發(fā)了一系列行業(yè)問題。由于進入門檻低、競爭無序，國內(nèi)企業(yè)不得不憑借國內(nèi)人力成本低的優(yōu)勢，趨向到國外接單、國內(nèi)合成的業(yè)務(wù)。

 

基因合成入行門檻不高，一些小的公司買一臺儀器，三四個人就可以從事這項工作，一個人去跑市場，攢夠訂單后就能開機。

 

基因合成行業(yè)拼的主要是儀器的通量。企業(yè)開機一次合成低于1000條BP是虧錢的，大規(guī)模、大通量才可以降低成本。

 

擠入這個行業(yè)者眾多，但基因合成技術(shù)還處于1.0版本，合成能力有限、合成周期較長、通量不高，因此，成本高。合成價格對于需求方而言仍然昂貴，也是國內(nèi)基因合成產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢的主因之一。